GLOSARIO:

-Clonación molecular: aislamiento e incorporación de un fragmento de ADN dentro de un vector en el cual puede replicarse.

-Gen: un segmento de ADN que codifica una proteína.

-Operón: un grupo de genes cuya expresión está controlada por un único operador.

-Plásmido: son elementos genéticos extra-cromosomales que se replican independientemente del cromosoma del hospedador.

-Replicación: síntesis de ADN utilizando otro ADN como molde.

-Restrictasa: enzima de restricción que reconoce y corta ADN bicatenario en secuencias específicas.

-Vector de clonación: elemento genético dentro del cual los genes pueden recombinarse y replicarse.


1. Introducción:

El objetivo de la práctica es llevar a cabo la clonación del gen de resistencia a la kanamicina (Km) proveniente del plásmido pTC192-Km en el plásmido pUC19, dando lugar al plásmido pUCK. Para esto, es necesario aplicar una serie de protocolos de laboratorio ordenados. Además se hace necesario la utilización de organismos procariotas como las bacterias donde insertaremos los plásmidos ya diseñados, para que en ellas se replique y amplifique. El organismo propicio para esto es Escherichia coli, la cepa DH5α.

El plásmido donde ligaremos nuestro inserto (gen de resistencia a kanamicina) posee un gen de resistencia a ampicilina. De esta forma, logramos discriminar las bacterias que han logrado incorporar el plásmido con nuestro inserto de las que no. Las que no posean el plásmido resultante de la ligación, serán resistentes a ampicilina y sensibles a kanamicina dando lugar a colonias azules, mientras que las que si incorporaron nuestro plásmido pUCK, serán resistentes a ampicilina y a kanamicina y darán lugar a colonias blancas.

2. Metodología y fundamento:

2.1. Digestión del plásmido:

Necesitamos cortar los plásmidos por sitios específicos, utilizamos además de tampón de restricción y agua destilada, la enzima de restricción BamHI. Como sabemos, este tipo de enzimas son las encargadas de cortar la doble hélice de ADN de forma específica, es decir, por secuencias determinadas.

2.2. Electroforesis en geles de agarosa:

Necesitamos, por una parte hacer un gel de agarosa, de bajo punto de fusión. Aplicamos el protocolo pertinente, dejamos enfriar hasta los 50 grados aproximadamente, sellamos la bandeja de electroforesis, colocamos el peine (es una estructura que simplemente hará unos pocillos en el gel donde luego cargaremos las muestras para iniciar la electroforesis). Una vez se haya enfriado el gel, retiramos con cuidado el peine e introducimos el conjunto en la cubeta de electroforesis. Por último, cubrimos el gel y rellenamos la cubeta con tampón de electroforesis (TAE). Ya solo nos queda cargar las muestras, con el ADN que digerimos en los pasos anteriores. Antes necesitamos tampón de carga, que se mezcla en los tubos que contienen el material genético, ayudados de una micropipeta y con extremo cuidado de no romper el gel lo cargamos en los pocillos. Por último conectamos la cubeta a una fuente de alimentación y esperamos a que el ADN corra por las “calles" del gel.

Concluida la electroforesis, teñiremos el gel con bromuro etidio (agente intercalante y extremadamente peligroso). Posteriormente, hay que utilizar un transiluminador de luz ultravioleta para poder ver los fragmentos de ADN. Lo que se aprecia, son bandas fluorescentes con zonas especificas mas luminiscentes. Esta luminiscencia se la da el bromuro de etidio que, como ya se mencionó, tiene la peculiaridad de insertarse entre las bases del ADN y fluorescer al ser excitado con luz ultravioleta.

2.3. Purificación del ADN de interés del gel:

A partir de este momento, tenemos que cortar con una cuchilla el gel exactamente por la banda que nos interesa. Tomaremos con la cuchilla el fragmento del gel cortado y lo introduciremos en un tubo Eppendorf. Tendremos entonces ya el ADN pero mezclado con el gel y, evidentemente, necesitamos eliminar este gel ya que necesitamos solo el material genético libre de cualquier otra sustancia. Para lograr esto, utilizaremos el kit “GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit” de la casa comercial Amersham Biosciences. Tenemos que, de forma ordenada, seguir una serie de pasos para obtener el ADN limpio:

1-Cortar la banda de interés en dos partes iguales e introducir cada parte en un tubo Eppendorf.
2-Añadir a cada tubo (2 tubos) 300 µl del buffer de captura.

3-Agitar los tubos en un vortex durante 30 segundos e introducirlos en un baño a 60ºC hasta que la agarosa se funda (10-15 minutos).

4-Colocar un tubo recolector por cada medio fragmento a purificar y colocar sobre este tubo recolector una columna GFX.

5-Cuando la agarosa se haya fundido, dar un pulso en una microcentrífuga para recolectar todo el gel fundido en la base del tubo Eppendorf y, con una micropipeta, transferir el contenido a la columna GFX con cuidado de no tocar la matriz de la misma.

6-Incubar a temperatura ambiente durante 1 minuto.

7-Centrifugar en una microcentrífuga a 14200 rpm durante 30 segundos.

8-Descartar el sobrenadante vaciando el tubo recolector y colocar el mismo de nuevo bajo la columna.

9-Añadir a la columna (no tocar la matriz de la misma) 500 µl del buffer de lavado. Centrifugar a 14200 rpm durante 30 segundos.

10-Eliminar el tubo recolector y colocar bajo la columna un tubo Eppendorf.

11-Añadir con cuidado a la columna 10 µl de agua milliQ.

12-Incubar los tubos 1 minuto a temperatura ambiente.

13-Centrifugar los tubos a 14200 rpm durante 1 minuto para obtener el ADN purificado y juntar el contenido de ambos tubos en uno solo.

2.4. Ligación:

Ahora, es el momento de unir o ligar los fragmentos de ADN, metiendolos en un plásmido especifico que posteriormente introduciremos en células procariotas en E. coli.

2.5. Transformación:

Cuando hablamos de transformación nos referimos al proceso en el cual deberemos introducir el plásmido de interés en células competentes de Escherichia coli de la cepa DH5α apropiada para este fin.

Después de todos los pasos que dicta el protocolo y, tras someter a un choque térmico las bacterias para facilitar así la captación del material genético, ya podemos sembrarlas en un medio de crecimiento. Tras incubar las placas a 37ºC aproximadamente 12-14 horas y, como ya comentamos anteriormente, encontraremos dos posibilidades:

- Las que NO posean el plásmido resultante de la ligación, serán resistentes a ampicilina y sensibles a kanamicina, dando lugar a colonias azules.

- Las que SI incorporaron nuestro plásmido pUCK, serán resistentes a ampicilina y a kanamicina y darán lugar a colonias blancas.