Obtención de células competetes mediante el método del RbCl

1- Un día antes, sembrar la cepa de E. coli en tubos de 10 ml con 5 ml de medio SOB suplementado con la solución stock de Mg (2 ml del stock de Mg por cada 100 ml de SOB). Incubar el tubo a 37ºC y 250 r.p.m. toda la noche.

2- Al día siguiente, se inocula en matraz 100 ml de SOB suplementado con 2 ml de la solución stock de Mg con 200-400 ml del preinóculo. El matraz se incuba a 37ºC y 250 r.p.m. hasta que se alcance una D.O.600 de 0,48.

3- Cuando se alcanza la D.O. (densidad óptica) deseada, el matraz se mantiene en hielo.

4- Centrifugar las células en tubos GSA a 4ºC durante 5 minutos a 5000 r.p.m.

5- Retirar el sobrenadante y resuspender el pellet de células en 30 ml de RF1. Mantener los tubos GSA en hielo durante 30 minutos.

6- Centrifugar los tubos GSA a 4ºC durante 5 minutos y a 5000 r.p.m.

7- Retirar el sobrenadante y resuspender el pellet de células en 8 ml de RF2.

8- Repartir en alícuotas de 120 ml en tubos Eppendorf que inmediatamente se congelarán en nitrógeno líquido. Los viales de células competentes se conservan a -80ºC.

RF1 (100 ml)

Concentración final
Cantidad
MW
RbCl
100 mM
1,209 g
120,9
MnCl2 4H2O
50 mM
0,989g
197,91
Acetato potásico
30 mM
3 ml stock 1M
98,14
CaCl2 2H2O
10 mM
0,147 g
147
Glicerol
15% (p/v)
17,241 ml (stock 87%)
-
Stocks
Ácido acético
0,2 M
Vf=50 ml
600 µl acético+49,4 ml H2O
60,05
(1 litro=1,05 Kg)
Acetato potásico pH 7.5
1M
Vf=50 ml
4,907 g
98,14

- Ajustar el pH del RF1 a 5,8 con ácido acético 0,2 M.

- Esterilizar por filtración.

RF 2 (50 ml)

Concentración final
Cantidad
MW
MOPS
10 mM
1 ml stock 0,5 M
231,2
RbCl
10 mM
0,06 g
120,9
CaCl2 2H2O
75 mM
0,551 g
147
Glicerol
15% (p/v)
8,620 ml (stock 87%)
-
Stocks
NaOH
1 N
Vf=50 ml
2 g
40
MOPS pH 6.8
(pH con HCl o NaOH 1N)
0,5 M
Vf=50 ml
5,78 g
231,2

- Ajustar el pH del RF 2 a 6,8 con NaOH 1N.

- Esterilizar por filtración.


MEDIO SOB (1 L)
Bacto-Triptona
20 g
NaCl
0,5 g
Extracto de levadura
5 g

- Ajustar el pH del SOB a 7.5 con KOH 1N.

- Esterilizar en olla 20 minutos.


STOCK 1 M MgCl2+Mg(SO4)2 (100 ml)

Concentración final
Cantidad
MW
MgCl2 6H2O
1 M
20,330
203,3
MgSO4 7H2O
1 M
24,648
246,48

- Esterilizar por filtración.