INTRODUCCIÓN:
Como complemento a vuestras prácticas de Microbiología del tercer curso de vuestra Licenciatura en Biología, en esta webquest se trata de explicar de forma concisa el proceso (protocolo) a seguir para la correcta elaboración y consecución de las mismas. Dichas prácticas están encaminadas a la comprensión de multitud de aspectos teóricos ya avanzados en clase y de aspectos fundamentales de dicha materia que cursareis en algunos de los cursos de vuestra licenciatura en Biología.

TAREA:
El trabajo que tendréis que desarrollar en las mencionadas prácticas, os debe permitir contestar (argumentando vuestra respuesta) a estas cuestiones:
-¿Cómo podré diferenciar entre aquellas bacterias que hayan incorporado la construcción correcta de aquellas que no lo han hecho?.
-¿Cuál crees que será el porcentaje relativo de unas respecta a las otras y en función de que podrá variar?.
-¿Cuales crees que son las restricciones en la incorporación de distintos vectores (plásmidos) por parte del microorganismo?.
-¿Cómo crees que se podrían solucionar dichas restricciones?.
-¿Frente a cuantos antibióticos distintos crees que podría mostrar resistencia un microorganismo?.
-¿Cómo elaborarías (a grandes rasgos) el medio de selección para cada uno de estos antibióticos?.
-¿Cuáles crees que son las ventajas y los inconvenientes de emplear E. coli como microorganismo hospedador de dichas construcciones?.

PROCESO:
-En primer lugar, el alumno/a deberá comprender el “como”, el “por qué” y el “para qué” de cada una de las prácticas que realice. Para ello, deberá valerse de las explicaciones del profesor (yo) y de la argumentación teórica adjunta a cada una de las prácticas. Para ello os dividiréis en grupos de cómo máximo tres personas. Cada persona deberá colaborar de forma activa tanto en la elaboración de la práctica como en la consecución de cada una de las mismas.
-Cada grupo de prácticas deberá entregar una memoria individualizada acerca de la práctica en cuestión, pudiéndose optar por la exposición pública del trabajo desarrollado. Dicha exposición se valorará con un máximo de 2,5 puntos que serán añadidos a la nota final de vuestro examen teórico.
-La exposición de vuestras prácticas deberá ser realizada en PowerPoint, debiéndose entregar una copia en papel de cada una de las diapositivas. Tras la exposición, el profesor podrá realizaros preguntas acerca de vuestra práctica o de cualquiera de las prácticas realizadas en la asignatura.
-El plazo de entrega de vuestras memorias será de quince días desde la finalización de las prácticas. Para la exposición oral de vuestro trabajo práctico contareis con otros quince días.
-Por último, el tiempo de exposición no deberá superar la hora. Para la contestación (debate) de las preguntas que os formule contareis con un máximo de 30 minutos.

RECURSOS:
En el siguiente listado de páginas web podréis encontrar información de interés:
http://www.joseacortes.com/practicas/index.htm
http://www.uv.es/~jjmateo/microb/
http://apuntes.rincondelvago.com/practicas_universidad/biologia/microbiologia/
www.uib.es/depart/dba/microbiologia/micro2/practicas.pdf
www.ucaldas.edu.co/index.php?option=com_content&task=view&id=313&Itemid=220
www.uned.es/portal/60/603042.pdf
https://www.epsg.upv.es/progasig/programas/imprimir.php?
www.umh.es/asignaturas/fichasignatura.asp?asi=6332
Además de la información de la web, en cuanto a conceptos y elementos teóricos puros, es muy aconsejable acudir a la bibliografía proporcionada en la asignatura.

EVALUACIÓN:
La correcta elaboración de las prácticas será una condición imprescindible para aprobar esta asignatura.
Así mismo, se valorarán positivamente los siguientes aspectos:
-La correcta comprensión de los diferentes conceptos y pasos seguidos en la elaboración de cada práctica.
-La presentación de vuestras memorias así como el correcto empleo de los términos propios y adecuados en cada una de las prácticas.
El la exposición pública de vuestras memorias se tendrán en cuenta los siguientes aspectos:
-La relevancia en la selección de elementos que expongáis a fin de hacer llegar una idea precisa al auditorio sobre el estudio realizado.
-La argumentación que realicéis a la hora de contestar a las diferentes preguntas que se os hagan.

CONCLUSIÓN:
La principal finalidad de esta webquest es conseguir que el alumno se familiarice con los distintos protocolos/técnicas empleados tanto en Microbiología como en Biología Molecular o en Biotecnología. Dichos protocolos serán empleados de forma rutinaria tanto en el trabajo de laboratorio en empresas del sector como (si decidieseis realizarla) en la realización de vuestras Tesis Doctorales al finalizar vuestra Licenciatura. Así mismo, será una herramienta imprescindible a la hora de desarrollar/ampliar vuestro Curriculum vitae mediante la publicación de vuestros trabajos tanto en revistas científicas como en las diferentes participaciones en Congresos que podáis tener.
A propósito de este último punto, la exposición oral de vuestro trabajo de prácticas os será de gran ayuda (combinado con el correcto aprendizaje/manejo de un idioma) y os servirá de experiencia cuando decidáis realizar vuestra comunicación al Congreso de forma oral.

Obtención de células competetes mediante el método del RbCl

1- Un día antes, sembrar la cepa de E. coli en tubos de 10 ml con 5 ml de medio SOB suplementado con la solución stock de Mg (2 ml del stock de Mg por cada 100 ml de SOB). Incubar el tubo a 37ºC y 250 r.p.m. toda la noche.

2- Al día siguiente, se inocula en matraz 100 ml de SOB suplementado con 2 ml de la solución stock de Mg con 200-400 ml del preinóculo. El matraz se incuba a 37ºC y 250 r.p.m. hasta que se alcance una D.O.600 de 0,48.

3- Cuando se alcanza la D.O. (densidad óptica) deseada, el matraz se mantiene en hielo.

4- Centrifugar las células en tubos GSA a 4ºC durante 5 minutos a 5000 r.p.m.

5- Retirar el sobrenadante y resuspender el pellet de células en 30 ml de RF1. Mantener los tubos GSA en hielo durante 30 minutos.

6- Centrifugar los tubos GSA a 4ºC durante 5 minutos y a 5000 r.p.m.

7- Retirar el sobrenadante y resuspender el pellet de células en 8 ml de RF2.

8- Repartir en alícuotas de 120 ml en tubos Eppendorf que inmediatamente se congelarán en nitrógeno líquido. Los viales de células competentes se conservan a -80ºC.

RF1 (100 ml)

Concentración final
Cantidad
MW
RbCl
100 mM
1,209 g
120,9
MnCl2 4H2O
50 mM
0,989g
197,91
Acetato potásico
30 mM
3 ml stock 1M
98,14
CaCl2 2H2O
10 mM
0,147 g
147
Glicerol
15% (p/v)
17,241 ml (stock 87%)
-
Stocks
Ácido acético
0,2 M
Vf=50 ml
600 µl acético+49,4 ml H2O
60,05
(1 litro=1,05 Kg)
Acetato potásico pH 7.5
1M
Vf=50 ml
4,907 g
98,14

- Ajustar el pH del RF1 a 5,8 con ácido acético 0,2 M.

- Esterilizar por filtración.

RF 2 (50 ml)

Concentración final
Cantidad
MW
MOPS
10 mM
1 ml stock 0,5 M
231,2
RbCl
10 mM
0,06 g
120,9
CaCl2 2H2O
75 mM
0,551 g
147
Glicerol
15% (p/v)
8,620 ml (stock 87%)
-
Stocks
NaOH
1 N
Vf=50 ml
2 g
40
MOPS pH 6.8
(pH con HCl o NaOH 1N)
0,5 M
Vf=50 ml
5,78 g
231,2

- Ajustar el pH del RF 2 a 6,8 con NaOH 1N.

- Esterilizar por filtración.


MEDIO SOB (1 L)
Bacto-Triptona
20 g
NaCl
0,5 g
Extracto de levadura
5 g

- Ajustar el pH del SOB a 7.5 con KOH 1N.

- Esterilizar en olla 20 minutos.


STOCK 1 M MgCl2+Mg(SO4)2 (100 ml)

Concentración final
Cantidad
MW
MgCl2 6H2O
1 M
20,330
203,3
MgSO4 7H2O
1 M
24,648
246,48

- Esterilizar por filtración.

Extracción de Bandas mediante el kit "Concert(TM) Matrix Gel Extraction System" de Gibco BRL

1- Antes de cortar las bandas, pesar 2 tubos Eppendorf de 2,2 ml. En cada tubo introduciremos una de las dos mitades de la banda.

2- Tras cortar las bandas e introducirlas en los tubos, pesarlos y obtener el peso de cada media banda.

3- Añadir 3 volúmenes de L1 en cada Eppendorf, según el peso de cada media banda.

4- Calentar el baño a 50ºC e introducir los Eppendorf hasta que se funda la agarosa.

5- Añadir 13 μl de resina en cada Eppendorf.

6- Meter los Eppendorf en el baño a 50ºC durante 10 minutos, agitando los tubos cada 2 minutos y medio.

7- Dar un pulso a los Eppendorf a 13.200 rpm durante 30 seg.

8- Realizar 3 lavados (500 μl/lavado), resuspendiendo el pellet en cada uno de ellos: L1, L2 y L2. Precipitar los pellet mediante centrifugación a 13.200 rpm durante 30 seg en cada lavado.

9- Tras el último lavado, eliminar cualquier resto de L2 con la pipeta y sin tocar el pellet. Dejar los tubos al aire 10-15 min.

10- Añadir 100 μl de TE (el del kit) a cada Eppendorf. Resuspender el pellet y calentar a 50ºC durante 5 min.

11- Centrifugar los Eppendorf a 13.200 durante 2 minutos.

12- Pasar las dos mitades de la banda a un tubo Eppendorf de 1,5 ml.

13- Centrifugar los Eppendorf a 13.200 durante 2 minutos (por si quedan restos de resina).

14- Pasar el sobrenadante del Eppendorf a un tubo nuevo y añadir: 10 μl de TE, 20 μl de AcNa 3M pH 5.2 y 3 volúmenes de ETOH abs.

15- Precipitar el DNA a -20ºC.

Esquema resumen de la práctica

GLOSARIO:

-Clonación molecular: aislamiento e incorporación de un fragmento de ADN dentro de un vector en el cual puede replicarse.

-Gen: un segmento de ADN que codifica una proteína.

-Operón: un grupo de genes cuya expresión está controlada por un único operador.

-Plásmido: son elementos genéticos extra-cromosomales que se replican independientemente del cromosoma del hospedador.

-Replicación: síntesis de ADN utilizando otro ADN como molde.

-Restrictasa: enzima de restricción que reconoce y corta ADN bicatenario en secuencias específicas.

-Vector de clonación: elemento genético dentro del cual los genes pueden recombinarse y replicarse.


1. Introducción:

El objetivo de la práctica es llevar a cabo la clonación del gen de resistencia a la kanamicina (Km) proveniente del plásmido pTC192-Km en el plásmido pUC19, dando lugar al plásmido pUCK. Para esto, es necesario aplicar una serie de protocolos de laboratorio ordenados. Además se hace necesario la utilización de organismos procariotas como las bacterias donde insertaremos los plásmidos ya diseñados, para que en ellas se replique y amplifique. El organismo propicio para esto es Escherichia coli, la cepa DH5α.

El plásmido donde ligaremos nuestro inserto (gen de resistencia a kanamicina) posee un gen de resistencia a ampicilina. De esta forma, logramos discriminar las bacterias que han logrado incorporar el plásmido con nuestro inserto de las que no. Las que no posean el plásmido resultante de la ligación, serán resistentes a ampicilina y sensibles a kanamicina dando lugar a colonias azules, mientras que las que si incorporaron nuestro plásmido pUCK, serán resistentes a ampicilina y a kanamicina y darán lugar a colonias blancas.

2. Metodología y fundamento:

2.1. Digestión del plásmido:

Necesitamos cortar los plásmidos por sitios específicos, utilizamos además de tampón de restricción y agua destilada, la enzima de restricción BamHI. Como sabemos, este tipo de enzimas son las encargadas de cortar la doble hélice de ADN de forma específica, es decir, por secuencias determinadas.

2.2. Electroforesis en geles de agarosa:

Necesitamos, por una parte hacer un gel de agarosa, de bajo punto de fusión. Aplicamos el protocolo pertinente, dejamos enfriar hasta los 50 grados aproximadamente, sellamos la bandeja de electroforesis, colocamos el peine (es una estructura que simplemente hará unos pocillos en el gel donde luego cargaremos las muestras para iniciar la electroforesis). Una vez se haya enfriado el gel, retiramos con cuidado el peine e introducimos el conjunto en la cubeta de electroforesis. Por último, cubrimos el gel y rellenamos la cubeta con tampón de electroforesis (TAE). Ya solo nos queda cargar las muestras, con el ADN que digerimos en los pasos anteriores. Antes necesitamos tampón de carga, que se mezcla en los tubos que contienen el material genético, ayudados de una micropipeta y con extremo cuidado de no romper el gel lo cargamos en los pocillos. Por último conectamos la cubeta a una fuente de alimentación y esperamos a que el ADN corra por las “calles" del gel.

Concluida la electroforesis, teñiremos el gel con bromuro etidio (agente intercalante y extremadamente peligroso). Posteriormente, hay que utilizar un transiluminador de luz ultravioleta para poder ver los fragmentos de ADN. Lo que se aprecia, son bandas fluorescentes con zonas especificas mas luminiscentes. Esta luminiscencia se la da el bromuro de etidio que, como ya se mencionó, tiene la peculiaridad de insertarse entre las bases del ADN y fluorescer al ser excitado con luz ultravioleta.

2.3. Purificación del ADN de interés del gel:

A partir de este momento, tenemos que cortar con una cuchilla el gel exactamente por la banda que nos interesa. Tomaremos con la cuchilla el fragmento del gel cortado y lo introduciremos en un tubo Eppendorf. Tendremos entonces ya el ADN pero mezclado con el gel y, evidentemente, necesitamos eliminar este gel ya que necesitamos solo el material genético libre de cualquier otra sustancia. Para lograr esto, utilizaremos el kit “GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit” de la casa comercial Amersham Biosciences. Tenemos que, de forma ordenada, seguir una serie de pasos para obtener el ADN limpio:

1-Cortar la banda de interés en dos partes iguales e introducir cada parte en un tubo Eppendorf.
2-Añadir a cada tubo (2 tubos) 300 µl del buffer de captura.

3-Agitar los tubos en un vortex durante 30 segundos e introducirlos en un baño a 60ºC hasta que la agarosa se funda (10-15 minutos).

4-Colocar un tubo recolector por cada medio fragmento a purificar y colocar sobre este tubo recolector una columna GFX.

5-Cuando la agarosa se haya fundido, dar un pulso en una microcentrífuga para recolectar todo el gel fundido en la base del tubo Eppendorf y, con una micropipeta, transferir el contenido a la columna GFX con cuidado de no tocar la matriz de la misma.

6-Incubar a temperatura ambiente durante 1 minuto.

7-Centrifugar en una microcentrífuga a 14200 rpm durante 30 segundos.

8-Descartar el sobrenadante vaciando el tubo recolector y colocar el mismo de nuevo bajo la columna.

9-Añadir a la columna (no tocar la matriz de la misma) 500 µl del buffer de lavado. Centrifugar a 14200 rpm durante 30 segundos.

10-Eliminar el tubo recolector y colocar bajo la columna un tubo Eppendorf.

11-Añadir con cuidado a la columna 10 µl de agua milliQ.

12-Incubar los tubos 1 minuto a temperatura ambiente.

13-Centrifugar los tubos a 14200 rpm durante 1 minuto para obtener el ADN purificado y juntar el contenido de ambos tubos en uno solo.

2.4. Ligación:

Ahora, es el momento de unir o ligar los fragmentos de ADN, metiendolos en un plásmido especifico que posteriormente introduciremos en células procariotas en E. coli.

2.5. Transformación:

Cuando hablamos de transformación nos referimos al proceso en el cual deberemos introducir el plásmido de interés en células competentes de Escherichia coli de la cepa DH5α apropiada para este fin.

Después de todos los pasos que dicta el protocolo y, tras someter a un choque térmico las bacterias para facilitar así la captación del material genético, ya podemos sembrarlas en un medio de crecimiento. Tras incubar las placas a 37ºC aproximadamente 12-14 horas y, como ya comentamos anteriormente, encontraremos dos posibilidades:

- Las que NO posean el plásmido resultante de la ligación, serán resistentes a ampicilina y sensibles a kanamicina, dando lugar a colonias azules.

- Las que SI incorporaron nuestro plásmido pUCK, serán resistentes a ampicilina y a kanamicina y darán lugar a colonias blancas.